EQUIPAMENTOS ANALÍTICOS

De LAMEB
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SUMÁRIO

CITÔMETRO DE FLUXO

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O CITÔMETRO DE FLUXO BD FACSCANTO II realiza os seguintes Parâmetros de análise:

  • Tamanho (FSC);
  • Complexidade (SSC);
  • Até oito diferentes fluoróforos;

Para saber mais sobre características do equipamento acesse:[1]

COMPENSAÇÃO CBA SET FLEX [2]

PROCEDIMENTO

Citômetro

1. Criar um novo experimento.

2. Para a compensação, terá cinco tubos nomeados da seguinte forma: A1, A9, F1 PE, F1 e F9.

3. Editar a lista de parâmetros para que sejam mostrados somente os seguintes: FSC-A, FSC-W, SSC-A, SSC-W, PE-A, APC-A e APC-Cy7-A.

4. Em uma Global Worksheet, criar os seguintes gráficos: dois dot-plots: FSC-A x SSC-A e APC-A x APC-Cy7-A dot plot; e um histograma de PE.

5. Definir FSC-A e SSC-A para Log e visualizar a estatística mostrando as médias de FSC-A e SSC-A. Definir para que sejam mostrados 500 eventos nos gráficos.

6. Adquirir o tubo de beads A9 e, ajustar as voltagens de FSC e SSC para que as beads apresentem uma média de fluorescência de 30.000 para cada parâmetro. Pare a aquisição da amostra sem salvar os dados.

7. Ajustar os valores de Threshold para FSC e SSC, cuidando para não cortar uma parte da população de beads.

8. No gráfico de dot-plot FSC-A x SSC-A, criar uma região (gating) que inclua toda a população de beads. Em Population Hierarchy, renomeie essa região.

9. Definir a estatística para mostrar as médias de fluorescência das beads em PE, APC, e APC-Cy7.

10. Adquirir o tubo de beads A9 e ajustar as voltagens de APC e APC-Cy7 para que as médias de fluorescência para cada parâmetro fiquem em torno de 160.000 ± 2.000.

11. Adquirir o tubo de beads PE-F1 e ajustar a voltagem de PE para que a média de fluorescência fique em torno de 65 ± 5.

12. Criar os controles de compensação e excluir o tubo de compensação PE. Adquirir os tubos com as beads como controles de compensação: Unstained: F1 APC Stained: F9 APC-Cy7 Stained: A1

13. Calcular a compensação.

OBSERVAÇÕES

1. Exportar os dados na versão 2.0.

2. Ajustar os eventos que devem ser gravados para 300 eventos por analito (ex.: 300 x 6 = 1800 eventos para um experimento 6 plex).

3. Ajustar para que sejam visualizados 5.000 event

COMO LIGAR Citômetro de Fluxo BD FACS Canto II [3]

PROCEDIMENTO

1. Ligar o computador e inserir a senha <BDIS> (letras maiúsculas).

Ligando o Computador









2. Ligar o citômetro (botão verde <System Power> localizado na lateral do equipamento).

Ligando o equipamento










3. Aguardar a conexão do equipamento (cerca de 30 segundos).

4. Abrir o software FACSDiva (ícone localizado na área de trabalho).

Abrindo Software










5. Aguardar o software se conectar ao citômetro de fluxo.

6. Caso a conexão não ocorra automaticamente, clicar em <Cytometer>, na barra superior, e selecione a opção <Connect>.

Conexão ao Equipamento










7. Aguardar alguns instantes até que a conexão entre o software e o equipamento se estabeleça.

Indicativos da Conexão






8. Caso a conexão não aconteça, repetir os passos 6 e 7.

9. Clicar no botão <Cytometer>, na barra superior, e selecionar a opção <Fluidics Startup>.

Fluidics Startup









up
ATENÇÃO!
  • Nenhum tubo pode estar na probe ao inicializar o sistema de fluidos.
Probe sem tubos



10. Aguardar até que o sistema de fluidos inicialize.

11. Aguardar até que os lasers se estabilizem.


Exclamation.png

ATENÇÃO!

  • Os tempos de inicialização do sistema de fluidos e de estabilização dos lasers podem ocorrer concomitamente e demoram em torno de 7 minutos.


12. O citômetro de fluxo está pronto para o uso.

COMO DESLIGAR Citômetro de Fluxo BD FACS Canto II [4]

PROCEDIMENTO

1. Exportar e salvar os arquivos gerados no experimento.

Exportação

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ATENÇÃO!

  • Em caso de dúvidas para a exportação dos dados, verificar o POP N°05 - Exportação dos Dados do Citômetro de Fluxo.









2. Fechar o experimento vigente e abrir o experimento <Limpeza>.

Limpeza









3. Colocar o tubo Hipoclorito de Sódio (tubo H, localizado na estante junto ao citômetro) na probe do equipamento. Adquirir em modo <Hi> durante 5 minutos.

4. Trocar o tubo Hipoclorito de Sódio pelo tubo Rinse (tubo R) na probe do equipamento. Adquirir em modo <Hi> durante 5 minutos.

5. Trocar o tubo Rinse pelo tubo Água Destilada (tubo A) na probe do equipamento. Adquirir em modo <Hi> durante 5 minutos.

6. Verificar se você é o último usuário do dia. Nos dias de semana: caso você não seja o último usuário:

7. Deixar o citômetro ligado. Caso você seja o último usuário:

8. Clicar em <Cytometer>, na barra superior, e selecionar a opção <Fluidics Shutdown>.

Limpeza











9. Aguardar a finalização do sistema de fluidos (cerca de 5 minutos).

10. Fechar o software FACSDiva e desligar o computador.

11. Desligar citômetro (botão verde <System Power> localizado na lateral do equipamento). Nos fins de semana: Caso você não seja o último usuário:

Limpeza











12. Clicar em <Cytometer>, na barra superior, e selecionar a opção <Stand by>. Caso você seja o último usuário:

13. Seguir os passos de 8 a 11.

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ATENÇÃO!

  • O equipamento nobreak, ligado ao citômetro de fluxo, deve permanecer ligado.


Desobstrução da Probe do Citômetro de Fluxo BD FACS Canto II [5]

PROCEDIMENTO

1. Parar a aquisição da atual amostra

2. Retirar o tubo da probe.

Remoção do Tubo da Probe












3. Colocar o tubo Hipoclorito de Sódio (tubo H) na probe do equipamento.

4. No software FACSDiva, clicar no botão <Cytometer>, localizado na barra superior, selecionar a opção <Cleaning Modes> e logo após, selecionar a opção <Cleaning Flow Cell>.

Cleaning Flow Cell









5. Repetir o item 4.

6. Retirar o tubo Hipoclorito de Sódio (tubo H) da probe do equipamento.

7. No software FACSDiva, clicar no botão <Cytometer>, localizado na barra superior, selecionar a opção <Cleaning Modes> e logo após, selecionar a opção <SIT Flush>.

SIT Flush









8. Colocar um tubo de amostra na probe para verificar se o sistema de fluidos foi desobstruído.

9. Caso ainda esteja obstruído, repetir os passos 3 a 8.

Exclamation.png ATENÇÃO!

1. Se estiverem acontecendo sucessivas obstruções do sistema de fluidos, é provável que o experimento esteja com algum dos seguintes problemas: (1) número excessivo de células; (2) presença de grumos celulares; (3) células de tamanho maior do que a capacidade da célula de fluxo do equipamento; (4) presença de sujeira em amostras não filtradas.

2. Caso o sistema de fluidos continue obstruído, deverá ser realizada a limpeza do sistema de fluidos, de acordo com o POP nº 10 - Limpeza do Sistema de Fluidos entre Experimentos.

3. Caso o tubo Hipoclorito de Sódio (tubo H) esteja vazio, o mesmo poderá ser enchido da seguinte forma:

  • No carrinho de fluidos, localizar o filtro de ar do FACS Cleaning Solution (filtro do meio).
FACS Cleaning Solution








  • Soltar a mangueira inferior que está conectada ao carrinho de fluidos, apertando o clipe metálico.
Soltando a Mangueira












  • Apertar a ponta dessa mangueira contra a parte interna do tubo H, de modo que a FACS Cleaning Solution escorra para dentro do tubo.
FACS Cleaning Solution











  • Reposicionar a mangueira no carrinho de fluidos, cuidando para fazer o encaixe correto.
FACS Cleaning Solution










Exportação dos Dados do Citômetro de Fluxo BD FACS Canto II [6]

PROCEDIMENTO

1. No software BD FACS Diva, abrir o experimento cujos dados serão exportados. Para isso, dar um duplo clique em cima do nome do experimento.

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2. Clicar com o botão direito do mouse em cima do experimento e selecionar a opção <Export> e, em seguida, a opção <FCS Files>.

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3. Selecionar, na caixa de diálogos, os parâmetros e a versão em que os dados deverão ser exportados (a versão depende do software quer será usado para as análises). Clicar em <OK>.

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4. Escolher o local no qual os dados serão salvos. Na caixa de diálogo <Save Export>, selecionar <D:\BDExport\FCS>.

CIT22.png












5. Aguardar a exportação dos dados.

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6. Salvar os dados em CD ou DVD, conforme o POP 025 – Instruções para salvar dados através do software CD Burner.

Limpeza do Sistema de Fluidos após Experimentos no Citômetro de Fluxo BD FACS Canto II [7]

PROCEDIMENTO

1. Fechar o experimento vigente.

2. Abrir o experimento <Limpeza>.

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3. Colocar o tubo Hipoclorito de Sódio (tubo H) na probe do equipamento. O tubo está localizado na estante junto ao equipamento.

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4. Adquirir a solução, em modo Hi, durante 5 minutos.

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5. Trocar o tubo H pelo tubo Rinse (tubo R). O tubo está localizado na estante junto ao equipamento.

6. Adquirir a solução, em modo Hi, durante 5 minutos.

7. Trocar o tubo R pelo tubo Água Destilada (tubo A). O tubo está localizado na estante junto ao equipamento.

8. Adquirir a solução, em modo Hi, durante 5 minutos.

9. Retirar o tubo A da probe do equipamento.

10. Fechar o experimento <Limpeza>.

MULTILEITORA EnSpire

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A MULTILEITORA ENSPIRE realiza os seguintes Parâmetros de análise:

  • Luminescência
    • Leituras de 400 nm a 650 nm
  • Ensaios Tecnologia Alfa (AlphaLISA®)
    • Leituras de 520 nm a 620 nm
  • Compatível com microplacas de 6 a 384 cavidades. Veja os modelos compatíveis: [8]
  • Controle de temperatura
  • Agitação orbital e linear
  • Leituras pontuais

Para saber mais sobre características do equipamento acesse:[9]

MULTILEITORA INFINITE M200 TECAN

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A MULTILEITORA MULTILEITORA INFINITE M200 TECAN realiza os seguintes Parâmetros de análise:

  • Absorbância
    • Leituras de 230* nm a 1000 nm
  • Fluorescência
    • Leituras de 230 nm a 850 nm
  • Luminescência
    • Total
    • Filtros Green 1, Green 2, Blue 1 e Magenta

Para saber mais sobre características do equipamento acesse:[10]


Ligar a Multileitora de Placas Infinite M200 Tecan [11]

PROCEDIMENTO

1. Ligar a multileitora (o botão ON/OFF está localizado atrás do equipamento, no canto inferior esquerdo).

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2. Ligar o computador.

3. Abrir o software Magellan (ícone localizado na área de trabalho).

Exclamation.png

ATENÇÃO!

  • O software só deve ser inicializado se o equipamento estiver ligado!


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4. Aguardar a abertura do software (em torno de 3 minutos).

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5. O equipamento está pronto para o uso.


Conexão Manual da Multileitora de Placas Infinite M200 Tecan [12]

PROCEDIMENTO

1. Após ligar o equipamento, caso não ocorra a conexão automática, irá aparecer a seguinte tela:

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2. Na caixa <Connect to Instrument>, clicar no botão <Cancel>.

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3. Na tela inicial do software Magellan, selecionar a opção <Miscellaneous>.

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4. Em <Instrument Control> selecione a opção <Change Instrument>.

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5. Em <Instrument>, selecionar <Infinite Series>.

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6. Em <Port> e <Stacker port> selecionar a opção <Find any>.

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7. Aguardar o software fazer a busca pelo equipamento.

8. Selecionar a opção localizada <Infinite 200> e clicar em <OK>.

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9. Aguardar a conexão do software com o equipamento.

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10. Clicar em <OK>.

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11. O equipamento está pronto para uso.

Desligar a Multileitora de Placas Infinite M200 Tecan [13]

PROCEDIMENTO

1. Verificar se as portas de placa e cubetas estão fechadas.

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2. Se o sistema de injeção foi utilizado, verificar se foi limpo adequadamente e se o injetor está corretamente encaixado.

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3. Fechar o software Magellan para isso, clicar no botão Exit Magellan.

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4. Desligar o computador.

5. Desligar o equipamento (o botão ON/OFF está localizado atrás do equipamento, no canto inferior esquerdo).

ATENÇÃO! O nobreak que está conectado ao equipamento deve permanecer constantemente ligado.

Limpeza dos Injetores da Multileitora Infinite M200 Tecan [14]

PROCEDIMENTO

MATERIAIS NECESSÁRIOS

  • Ácido acético 30%
  • Etanol 70%
  • Água destilada
  • Béquer



1. No software Magellan, selecionar a opção <Miscellaneous>.

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2. Selecionar a opção <Instrument Control>.

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3. Selecionar a opção <Injector Control>, para acessar a aba de manutenção dos injetores.

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4. Na aba <Wash>, em <Select Injector> selecionar o injetor no qual será realizada a limpeza.

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5. Ainda aba <Wash>, em <Piston Strokes> digitar 7, para que a operação seja repetida 7x.

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6. Encher o reservatório do injetor com água destilada. Para isso, abrir a tampa da caixa de injetores.

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7. Retirar o injetor de dentro do equipamento.

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8. Encaixar o injetor na posição de manutenção e posicionar o béquer abaixo do injetor, para coletar o líquido que será descartado.

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9. Encaixar a cânula do injetor no frasco de água destilada.

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10. No software Magellan, na aba <Prime>, clicar em <Start Wash>.

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11. Após os sete ciclos, retirar a cânula do injetor no frasco de água destilada, esvaziar o conteúdo do béquer na pia e encaixar a cânula do injetor no frasco de etanol 70% (ou ácido acético 30%), conforme indicado no item 9.

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12. No software Magellan, na aba <Prime>, selecionar o injetor e clicar em <Start Prime>.

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13. Deixar o injetor parado, cheio de álcool 70%, durante 5 min.

14. Na aba <Wash>, em <Piston Strokes> digitar 7, para que a operação seja repetida 7x.

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15. Após os sete ciclos, retirar a cânula do injetor no frasco de etanol 70% (ou ácido acético 30%), esvaziar o conteúdo do béquer na pia e encaixar a cânula do injetor, novamente, no frasco de água destilada, conforme indicado no item 9.

16. Repetir os itens 4 e 5.

17. Ainda com o frasco de água destilada, repetir o passo 12, em seguida retirar a cânula do frasco de água destilada e esvaziar o conteúdo do béquer na pia.

19. Encaixar o injetor no equipamento.

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20. Fechar a tampa da caixa de injetores.

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ATENÇÃO!

  • O procedimento de limpeza dos injetores deve ser realizado SEMPRE que os injetores forem utilizados.